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熒光顯微鏡原理應用及使用

日期：2024-07-30 08:53

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摘要：

()熒光顯微鏡的原理和結構特點(diǎn)：熒光顯微鏡是利用個(gè)發(fā)光效率的點(diǎn)光源，經(jīng)過(guò)濾色系統發(fā)出定波長(cháng)的光(如紫外光3650入或紫藍光4200入)作為激發(fā)光、激發(fā)標本內的熒光物質(zhì)發(fā)射出各種不同顏色的熒光后，再通過(guò)物鏡和目鏡的放大進(jìn)行觀(guān)察。這樣在強烈的對襯背景下，即使熒光很微弱也易辨認，敏感性，主要用于細胞結構和功能以及化學(xué)成分等的研究。熒光顯微鏡的基本構造是由普通光學(xué)顯微鏡加上些附件(如熒光光源、激發(fā)濾片、雙色束分離器和阻斷濾片等)的基礎上組成的。熒光光源——般采用超壓汞燈(50200W)，它可發(fā)出各種波長(cháng)的光，但每種熒光物質(zhì)都有個(gè)產(chǎn)生強熒光的激發(fā)光波長(cháng)，所以需加用激發(fā)濾片（般有紫外、紫色、藍色和綠色激發(fā)濾片），僅使定波長(cháng)的激發(fā)光透過(guò)照射到標本上，而將其他光都吸收掉。每種物質(zhì)被激發(fā)光照射后，在短時(shí)間內發(fā)射出較照射波長(cháng)更長(cháng)的可見(jiàn)熒光。熒光具有專(zhuān)性，般都比激發(fā)光弱，為能觀(guān)察到專(zhuān)的熒光，在物鏡后面需加阻斷(或壓制)濾光片。它的作用有：是吸收和阻擋激發(fā)光進(jìn)入目鏡、以免于擾熒光和損傷眼睛，是選擇并讓特異的熒光透過(guò)，表現出專(zhuān)的熒光色彩。兩種濾光片必須選擇配合使用。

熒光顯微鏡就其光路來(lái)分有兩種：

1．透射式熒光顯微鏡: 激發(fā)光源是通過(guò)聚光鏡穿過(guò)標本材料來(lái)激發(fā)熒光的。常用暗視野集光器，也可用普通集光器，調節反光鏡使激發(fā)光轉射和旁射到標本上．這是比較舊式的熒光顯微鏡。其點(diǎn)是低倍鏡時(shí)熒光強，而缺點(diǎn)是隨放大倍數增加其熒光減弱．所以對觀(guān)察較大的標本材料較好。

2．落射式熒光顯微鏡這是近代發(fā)展起來(lái)的新式熒光顯微鏡，與上不同處是激發(fā)光從物鏡向下落射到標本表面，即用同物鏡作為照明聚光器和收集熒光的物鏡。光路中需加上個(gè)雙色束分離器，它與光鈾呈45。角，激發(fā)光被反射到物鏡中，并聚集在樣品上，樣品所產(chǎn)生的熒光以及由物鏡透鏡表面、蓋玻片表面反射的激發(fā)光同時(shí)進(jìn)入物鏡，反回到雙色束分離器，使激發(fā)光和熒光分開(kāi)，殘余激發(fā)光再被阻斷濾片吸收。如換用不同的激發(fā)濾片／雙色束分離器／阻斷濾片的組合插塊，可滿(mǎn)足不同熒光反應產(chǎn)物的需要。此種熒光顯微鏡的點(diǎn)是視野照明均勻，成像清晰，放大倍數愈大熒光愈強。

（）熒光顯微鏡使用方法。

1．打開(kāi)燈源，超壓汞燈要預熱幾分鐘才能達到亮點(diǎn)。

2．透射式熒光顯微鏡需在燈源與聚光器之間裝上所要求的激發(fā)濾片，在物鏡的后面裝上相應的阻斷濾片。落射式熒光顯微鏡需在光路的插槽中插入所要求的激發(fā)濾片／雙色束分離器／阻斷濾片的插塊。

3．用低倍鏡觀(guān)察，根據不同型號熒光顯微鏡的調節裝置，調整光源中心，使其位于整個(gè)照明光斑的中央。

4．放置標本片，調焦后即可觀(guān)察。使用中應注意：末裝濾光片不要用眼直接觀(guān)察，以免引起眼的損傷；用油鏡觀(guān)察標本時(shí)，必須用無(wú)熒光的特殊油鏡；壓汞燈關(guān)閉后不能立即重新打開(kāi)，需經(jīng)5分鐘后才能再啟動(dòng)，否則會(huì )不穩定，影響汞燈壽命。

(三)觀(guān)察在示教臺上的熒光顯微鏡下用藍紫光濾光片，可見(jiàn)經(jīng)o．01％的丫啶橙熒光染料染色的細胞，細胞核和細胞質(zhì)被激發(fā)產(chǎn)生兩種不同顏色的熒光(暗綠色和橙紅色)。

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