蛋白質(zhì)分離純化程序步驟

 
()材料的預處理及細胞破碎
 
分離提純某種蛋白質(zhì)時(shí)，先要把蛋白質(zhì)從組織或細胞中釋放出來(lái)并保持原來(lái)的天然狀態(tài)，不喪失活性。所以要采用適當的方法將組織和細胞破碎。常用的破碎組織細胞的方法有：
 
1. 機械破碎法
這種方法是利用機械力的剪切作用，使細胞破碎。常用設備有，速組織搗碎機、勻漿器、研缽等。
 
2. 滲透破碎法
這種方法是在低滲條件使細胞溶脹而破碎。
 
3. 反復凍融法
生物組織經(jīng)凍結后，細胞內液結冰膨脹而使細胞脹破。這種方法簡(jiǎn)單方便，但要注意那些對溫度變化敏感的蛋白質(zhì)不宜采用此法。
 
4. 超聲波法
使用超聲波震蕩器使細胞膜上所受張力不均而使細胞破碎。
 
5. 酶法
如用溶菌酶破壞微生物細胞等。
 
() 蛋白質(zhì)的抽提
 
通常選擇適當的緩沖液溶劑把蛋白質(zhì)提取出來(lái)。抽提所用緩沖液的pH、離子強度、組成成分等條件的選擇應根據欲制備的蛋白質(zhì)的性質(zhì)而定。如膜蛋白的抽提，抽提緩沖液中般要加入表面活性劑(十烷基磺酸鈉、tritonX-100等)，使膜結構破壞，利于蛋白質(zhì)與膜分離。在抽提過(guò)程中，應注意溫度，避免劇烈攪拌等，以防止蛋白質(zhì)的變性。
 
(三)蛋白質(zhì)粗制品的獲得
 
選用適當的方法將所要的蛋白質(zhì)與其它雜蛋白分離開(kāi)來(lái)。比較方便的有效方法是根據蛋白質(zhì)溶解度的差異進(jìn)行的分離。常用的有下列幾種方法：
 
1. 等電點(diǎn)沉淀法
不同蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，可用等電點(diǎn)沉淀法使它們相互分離。
 
2. 鹽析法
不同蛋白質(zhì)鹽析所需要的鹽飽和度不同，所以可通過(guò)調節鹽濃度將目的蛋白沉淀析出。被鹽析沉淀下來(lái)的蛋白質(zhì)仍保持其天然性質(zhì)，并能再度溶解而不變性。
 
3. 有機溶劑沉淀法
中性有機溶劑如乙醇、丙酮，它們的介電常數比水低。能使大多數球狀蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度降低，進(jìn)而從溶液中沉淀出來(lái)，因此可用來(lái)沉淀蛋白質(zhì)。此外，有機溶劑會(huì )破壞蛋白質(zhì)表面的水化層，促使蛋白質(zhì)分子變得不穩定而析出。由于有機溶劑會(huì )使蛋白質(zhì)變性，使用該法時(shí)，要注意在低溫下操作，選擇合適的有機溶劑濃度。
 
(四)樣品的進(jìn)步分離純化
 
用等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法所得到的蛋白質(zhì)般含有其他蛋白質(zhì)雜質(zhì)，須進(jìn)步分離提純才能得到有定純度的樣品。常用的純化方法有：凝膠過(guò)濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等等。有時(shí)還需要這幾種方法聯(lián)合使用才能得到較純度的蛋白質(zhì)樣品。
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