PCR實(shí)驗如實(shí)預防實(shí)驗污染

進(jìn)行PCR操作時(shí)，操作人員應該嚴格遵守些操作規程，大程度地降低可能出現的PCR污染或杜污染的出現。

1.劃分操作區：目前，普通PCR尚不能做到單人單管，實(shí)現完全閉管操作，但無(wú)論是否能夠達到單人單管，均要求實(shí)驗操作在三個(gè)不同的區域內進(jìn)行，PCR的前處理和后處理要在不同的隔離區內進(jìn)行：

(1)標本處理區，包括擴增摸板的制備。

(2)擴增區，包括反應液的配制和PCR擴增。

(3)產(chǎn)物分析區，凝膠電泳分析，產(chǎn)物拍照及重組克隆的制備。

(4)各工作區要有定的隔離，操作器材專(zhuān)用，要有定的方向性。如：標本制備→PCR擴增→產(chǎn)物分析→產(chǎn)物處理。

切記：產(chǎn)物分析區的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個(gè)工作區。

2.分裝試劑：PCR擴增所需要的試劑均應在裝有紫外燈的超凈工作臺或負壓工作臺配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中，不能用來(lái)吸取擴增后的DNA和其他來(lái)源的DNA：

(1) PCR用水應為壓的雙蒸水。

(2) 引物和dNTP用壓的雙蒸水在無(wú)PCR擴增產(chǎn)物區配制。

(3)引物和dNTP應分裝儲存，分裝時(shí)應標明時(shí)間，以備發(fā)生污染時(shí)查找原因。

3. 實(shí)驗操作注意事項：盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽(yáng)性反應的原因，樣品間的交叉污染也是原因之。因此，不僅要在進(jìn)行擴增反應是謹慎認真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環(huán)節都應該注意：

(1)戴次性手套，若不小心濺上反應液，立即更換手套。

(2)使用次性吸頭，嚴禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長(cháng)時(shí)間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染。

(3)避免反應液飛濺，打開(kāi)反應管時(shí)為避免此種情況，開(kāi)蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面。

(4)操作多份樣品時(shí)，制備反應混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應的度。

(5)后加入反應模板，加入后蓋緊反應管。

(6)操作時(shí)設立陰陽(yáng)性對照和空白對照，即可驗證PCR反應的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴增系統的可信性。

(7)盡可能用可替換或可壓處理的加樣器，由于加樣器容易受產(chǎn)物氣溶膠或標本DNA的污染，好使用可替換或壓處理的加樣器。如沒(méi)有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過(guò)程中加樣器應該專(zhuān)用，不能交叉使用，尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個(gè)區。

(8)重復實(shí)驗，驗證結果，慎下結論。